透射熒光顯微鏡與反射熒光顯微鏡的區(qū)別及優(yōu)缺點(diǎn)
1、透射熒光顯微鏡:激發(fā)光源通過聚光鏡穿過試樣材料激發(fā)熒光。常用暗場聚光器,也可使用普通聚光器,調(diào)節(jié)反射鏡使激發(fā)光向試樣轉(zhuǎn)移和側(cè)射。這是一種相對老式的熒光顯微鏡。優(yōu)點(diǎn)是在低倍率下熒光強(qiáng),但缺點(diǎn)是隨著倍率的增加熒光減弱。因此,最好觀察較大的試樣材料。
2、落射熒光顯微鏡:這是現(xiàn)代發(fā)展起來的一種新型熒光顯微鏡。不同之處在于激發(fā)光從物鏡下落到試樣表面,即照明聚光器和收集熒光的物鏡使用同一個物鏡。需要在與光學(xué)鈾成 45 度角的光路中添加二色分束器。激發(fā)光被反射到物鏡中并集中在樣品上。樣品產(chǎn)生的熒光被物鏡表面和蓋玻片表面反射。同時,激發(fā)光進(jìn)入物鏡,返回二向色分光鏡,使激發(fā)光和熒光分離,剩余激發(fā)光被阻擋濾光片吸收。例如,可以使用不同的激發(fā)濾光片/雙色分光鏡/阻擋濾光片的組合來滿足不同熒光反應(yīng)產(chǎn)物的需要。這種熒光顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)是視野均勻,成像清晰,放大倍數(shù)越大,熒光越強(qiáng)。
透射熒光顯微鏡的優(yōu)缺點(diǎn)
光源:高壓汞燈或鹵素?zé)簟?/span>
聚光鏡:使用暗場聚光鏡來分離激發(fā)光和熒光。
目標(biāo):可以使用任何類型的目標(biāo)。
標(biāo)本:因為是透射觀察,薄標(biāo)本比較適合。
優(yōu)點(diǎn):①由于使用了暗場聚光鏡,激發(fā)光不能進(jìn)入物鏡,因此容易形成暗背景并獲得良好的對比度,任何物鏡都可以進(jìn)行觀察。 ② 使用低倍物鏡時,比反射熒光顯微鏡更亮。
缺點(diǎn):聚光鏡的中心和高度必須調(diào)整正確,否則無法獲得明亮的熒光圖像。由于暗場聚光鏡的焦距限制,不能使用厚載玻片。視場的照明面積不宜過大,否則熒光標(biāo)本的熒光顏色很容易褪色。不適用于厚的或不透明的樣品。
反射熒光顯微鏡的優(yōu)缺點(diǎn)
光源:高壓汞燈或鹵素?zé)簟?/span>
聚光鏡:由于物鏡充當(dāng)聚光鏡,因此不需要聚光鏡。
事物鏡子:使用的物鏡必須透過足夠的紫外光,本身不產(chǎn)生熒光,對數(shù)值孔徑?jīng)]有限制。
標(biāo)本:可以觀察到厚標(biāo)本或不透明標(biāo)本。
優(yōu)點(diǎn):①由于物鏡兼作聚光鏡,無需進(jìn)行多次調(diào)整。 ②孔徑光闌和視場光闌的效果可以通過使用Korra照明法來發(fā)揮。 ③物鏡的數(shù)值孔徑不受限制,在高倍率下也可以獲得高分辨率的圖像。 ④也可以觀察厚或不透明的標(biāo)本,也可以使用厚蓋玻片。 ⑤其他觀察方法也可與反射熒光結(jié)合使用,特別是與相差法和透射微分干涉差法結(jié)合使用。 ⑥可避免不必要的熒光褪色現(xiàn)象。
缺點(diǎn):使用地倍率物鏡時,成像比較暗,必須使用數(shù)值孔徑大的物鏡。濾光片系統(tǒng)必須有效地分離激發(fā)光和熒光。
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